Takze te testowane slynnym Pe-Ce-Er wysylaja sygnaly,tak wynika z filmu.
https://www.mdpi.com/1420-3049/27/17/5405-
Tekst chyba od @cedrica ,ze Nattokinaza rozklada/unieszkodliwia srovida/bialko kolczaste.
Degradacyjny wpływ nattokinazy na białko kolca SARS-CoV-2
first_pageUstawieniaZamów przedruki artykułów
Otwarty dostępArtykuł
Degradacyjny wpływ nattokinazy na białko kolca SARS-CoV-2
przez Takashi Tanikawa 1,*,†,Yuka Kiba 2,†,James Yu 3,Kate Hsu 3,Shinder Chen 3,Ayako Ishii 4,Takami Yokogawa 2ORCID,Ryuichiro Suzuki 5,Yutaka Inoue 1ORCID iMasashi Kitamura 2,*
1
Laboratorium Zarządzania Nutri-Pharmacotherapeutics, School of Pharmacy, Wydział Farmacji i Nauk Farmaceutycznych, Josai University, Saitama 350-0295, Japonia
2
Laboratorium Farmakognocy, Szkoła Farmacji, Wydział Farmacji i Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Josai, Saitama 350-0295, Japonia
3
Contek Life Science Co., Ltd., Taipei City 100007, Tajwan
4
CellMark Japan, Tokio 102-0071, Japonia
5
Laboratorium Produktów Naturalnych i Fitochemii, Wydział Nauk Farmaceutycznych, Wydział Farmacji i Nauk Farmaceutycznych, Uniwersytet Josai, Saitama 350-0295, Japonia
*
Autorzy, do których należy kierować korespondencję.
†
Autorzy ci w równym stopniu przyczynili się do tej pracy.
Cząsteczki 2022, 27(17), 5405;
https://doi.org/10.3390/molecules27175405
Otrzymano: 14 lipca 2022 / Zmieniono: 17 sierpnia 2022 r. / Zaakceptowano: 23 sierpnia 2022 / Opublikowano: 24 sierpnia 2022
(Ten artykuł należy do Special Issue Bioactive Compounds in Healthy Fermented Food)
Pobierać Przeglądaj figury Raporty z przeglądu Wersje Uwagi
Abstrakt
Choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19), wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), pojawiła się jako pandemia i wyrządziła ogromne szkody w życiu ludzi i gospodarce wielu krajów na całym świecie. Jednak środki terapeutyczne przeciwko SARS-CoV-2 pozostają niejasne. SARS-CoV-2 ma białko spike (białko S), a rozszczepienie białka S jest niezbędne do wejścia wirusa. Nattokinase jest wytwarzana przez Bacillus subtilis var. natto i jest korzystna dla zdrowia ludzkiego. W tym badaniu zbadaliśmy wpływ nattokinazy na białko S SARS-CoV-2. Kiedy lizaty komórkowe transfekowane białkiem S inkubowano z nattokinazą, białko S uległo degradacji w sposób zależny od dawki i czasu. Analiza immunofluorescencji wykazała, że białko S na powierzchni komórki uległo degradacji po dodaniu nattokinazy do pożywki hodowlanej. Tak więc nasze odkrycia sugerują, że nattokinaza wykazuje potencjał do hamowania infekcji SARS-CoV-2 poprzez degradację białka S.
Słowa kluczowe: SARS-CoV-2; nattokinase; COVID-19
1. Wstęp
Choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19), wywołana przez koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), rozprzestrzenia się na całym świecie. Pandemia COVID-19 dotknęła ponad 437 mln osób i spowodowała ponad 6,3 mln zgonów (
https://covid19.who.int/, dostęp 4 lipca 2022 r.). W wejściu SARS-CoV-2 do komórek gospodarza pośredniczy transbłonowe białko kolca (białko S), które tworzy homotrimery, które rozciągają się od otoczki wirusa. Białko S jest przetwarzane i aktywowane przez proteazy komórkowe, w tym transbłonowe białko serynowe 2 (TMPRSS2), katepsynę i furynę. Składa się z dwóch podjednostek funkcjonalnych, S1 i S2; podjednostka S1 SARS-CoV-2 inicjuje wiązanie wirus-receptor poprzez interakcję z enzymem konwertującym angiotensynę 2 (ACE2) receptorem ludzkiej komórki gospodarza, a podjednostka S2 uczestniczy w fuzji wirusa z komórką docelową, umożliwiając wejście wirusa [1]. Domena wiążąca receptor (RBD) w podjednostce S1 jest odpowiedzialna za wiązanie z ACE2. Rozszczepienie białek S występuje na granicy między podjednostkami S1 i S2.
Obecnie wiele krajów jest zaangażowanych w opracowywanie szczepionek chroniących przed zakażeniem SARS-CoV-2, dlatego liczba zakażeń SARS-CoV-2 spadła. Zgłoszono jednak liczne warianty SARS-CoV-2, w tym szczepy ze zmutowanymi epitopami docelowymi szczepionek [2,3]. Szczepienie może nie chronić całkowicie przed zakażeniem SARS-CoV-2, ponieważ liczba pacjentów z COVID-19 wzrasta po szczepieniu. Dlatego ważne jest opracowanie nowych metod leczenia zakażeń SARS-CoV-2.
Natto to popularna tradycyjna japońska żywność wytwarzana z soi fermentowanej przez Bacillus subtilis var. natto. Nattokinase znajduje się w natto [4] i jest jednym z najważniejszych enzymów zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez B. subtilis var. natto [5]. Nattokinase składa się z 275 aminokwasów i wynosi około 28 kDa [6,7]. Nattokinase inaktywuje inhibitor aktywatora plazminogenu-1 i zwiększa fibrynolizę [8]. Zmniejsza również poziom fibrynogenu, czynnika VII, cytokin i czynnika VIII w osoczu [9]. Nattokinase ma najwyższą moc rozpuszczania skrzepów wśród naturalnie znanych antykoagulantów [10]. Badanie kliniczne wykazało, że doustne spożycie nattokinazy nie wiązało się z żadnymi działaniami niepożądanymi [11]. Tak więc nattokinaza jest obecnie uważana za wydajny, bezpieczny i ekonomiczny enzym, który zwrócił główną uwagę w badaniach leków trombolitycznych [12,13]. Ponadto nattokinaza jest stosowana w leczeniu niektórych nowotworów [14,15].
Ostatnie badania wykazały, że ekstrakt natto hamuje zakażenie wirusem opryszczki bydła 1 (BHV-1) i SARS-CoV-2 [16]. Wyniki te wskazują, że proteaza ekstraktu natto może być skuteczna przeciwko zakażeniu SARS-CoV-2. W tym badaniu chcieliśmy zbadać, czy hamowanie infekcji SARS-CoV-2 przez ekstrakt natto jest spowodowane przez nattokinazę pochodzącą z B. subtilis var. natto.
2. Wyniki i dyskusja
2.1. Degradacyjne działanie nattokinazy na białko spike SARS-CoV-2 in vitro
Najpierw zbadaliśmy, czy nattokinaza w ekstrakcie natto może degradować białko SARS-CoV-2 S. Białko S SARS-CoV-2 odgrywa ważną rolę w receptorze ACE2 komórki gospodarza we wczesnych stadiach infekcji [17]. Po zmieszaniu lizatu komórek ekspresji białka S z 4-krotną serią rozcieńczeń nattokinazy (32 μg/ml, 8 μg/ml, 2 μg/ml, 500 ng/ml, 125 ng/ml, 31,25 ng/ml i 7,8125 ng/ml) wykonano Western blotting. Pełna długość białka S (podjednostki S1 i S2) i podjednostki S2 pojawiła się jako pasma, gdy lizat komórek ekspresji białka S inkubowano z D-PBS w stężeniach nattokinazy 500 ng / ml, 125 ng / ml, 31,25 ng / ml i 7,8125 ng / ml (ryc. 1A). Następnie zbadaliśmy, czy nattokinaza degraduje białko S w sposób zależny od czasu. Lizat inkubowano następnie z nattokinazą 1 μg / ml przez 10-180 minut. Białko S SARS-CoV-2 zostało zdegradowane przez nattokinazę po 60-180 minutach inkubacji, ale nie po 10 i 30 minutach inkubacji (ryc. 1B). W ten sposób nattokinaza degradowała białko S w sposób zależny od dawki i czasu.
Molekuły 27 05405 g001a 550Molekuły 27 05405 g001b 550Ryc. 1. (A) Degradacyjne działanie nattokinazy w sposób zależny od dawki. Seryjnie rozcieńczoną nattokinazę (32 μg/ml, 8 μg/ml, 2 μg/ml, 500 ng/ml, 125 ng/ml, 31,25 ng/ml i 7,8125 ng/ml) zmieszano z lizatem komórek ekspresyjnych białka S i inkubowano. Pełną długość białka S (podjednostki S1 i S2) i podjednostki S2 wykryto odpowiednio jako górne i dolne pasmo. Stosunek całkowitego S wskazano jako względną ilość białka S (białko S + białko S2). (B) Degradacyjne działanie nattokinazy w sposób zależny od czasu. Lizat komórek ekspresji białka S inkubowano z nattokinazą o masie 1 μg/ml przez 0, 10, 30, 60, 120 i 180 min. (C) Skutki leczenia termicznego lub inhibitorów proteazy. Linia 1: lizat HEK293; pas 2: lizat HEK293 (białko S); linia 3: HEK293 (białko S) + nattokinaza (5 μg/ml); linia 4: HEK293 (białko S) + nattokinaza (5 μg/ml) + inhibitor proteazy I; pas 5: HEK293 (białko S) + nattokinaza (5 μg/ml) + inhibitor proteazy III; linia 6: HEK293 (białko S) + nattokinaza poddana obróbce cieplnej (5 μg/ml). (D) Degradacyjny wpływ białka S i ACE2 na RBD. RBD białka S i plazmidy kodujące ACE2 transfekowano odpowiednio komórkami HEK293. Lizaty komórkowe inkubowano z nattokinazą (7,5 μg / ml) i nattokinazą poddaną obróbce cieplnej (7,5 μg / ml) i wykonano Western blotting.
Aby potwierdzić, czy działanie degradacyjne nattokinazy wynika z aktywności enzymatycznej, nattokinase poddano działaniu ogrzewania lub koktajlu inhibitora proteazy. Gdy nattokinaza była podgrzewana w temperaturze 100 °C przez 5 minut, efekt degradacji nattokinazy został utracony (ryc. 1C, pas 6). Ponadto utrata pasm białka S przez nattokinazę została zablokowana po dodaniu inhibitorów proteazy (ryc. 1C, linie 4 i 5). W porównaniu z koktajlem inhibitora białka I, koktajl białkowy III, który składał się z chlorowodorku fluorku fluorku benzenosulfonylu AEBSF, który składał się z chlorowodorku fluorku 4-(2-aminoetylo) benzenosulfonylu), aprotyniny, która jest nieodwracalnym inhibitorem proteazy serynowej i leupeptyny, która jest proteazą cysteiny, wyraźnie blokował aktywność nattokinazy. Nattokinase ma te same zachowane aminokwasy, Ser-His-Asp (Asp32Jego64i Ser221), które należą do rodziny subtilizyny proteaz serynowych [6,18]. Struktura krystaliczna nattokinazy jest prawie identyczna jak struktura subtilizyny E z B. subtilis DB104 [19]. Wynik ten jest zgodny z wynikami poprzedniego raportu, że nattokinaza jest proteazą seryny. Oceniliśmy również degradacyjne działanie nattokinazy za pomocą lizatów komórkowych wykazujących ekspresję RBD i ACE2. Po inkubacji 7,5 μg / ml nattokinazy i lizatu komórkowego utracono pasma RBD i ACE2 (ryc. 1D).
2.2. Degradacyjny wpływ nattokinazy na białko spike SARS-CoV-2 na powierzchni transfekowanej komórki
Następnie zbadaliśmy, czy nattokinaza degraduje białko S na powierzchni transfekowanej komórki. Białko S transfekowano komórkami HEK293. Transfekowane komórki inkubowano z nattokinazą przez 9 godzin. Białko S na powierzchni komórki wykryto za pomocą przeciwciała anty-S bez przepuszczalności komórek (ryc. 2A). Białko S wykryto w transfekowanych komórkach. Kiedy transfekowane komórki były traktowane nattokinazą, białko S na powierzchni komórki zmniejszyło się. Gdy komórki traktowano nattokinazą 25 μg / ml i 2,5 μg / ml, stosunek obszaru dodatniego białka S do obszaru dodatniego jądra zmniejszył się odpowiednio o około 0,3 i 0,7 (ryc. 2B). Działanie degradujące nattokinazy obserwowano przy braku cytotoksyczności (ryc. 2C). Analiza Western blotting wykazała, że ilość całkowitego białka S nie zmieniła się wśród nattokinase i leczenia kontrolnego (Supplemental Figure; Rysunek S1). Wyniki te wskazują, że nattokinaza degradowałaby białko S SARS-CoV-2 w zakresie nietoksycznych stężeń.
Molekuły 27 05405 g002 550Ryc. 2. (A) Degradacyjny wpływ nattokinazy na białko S na powierzchni komórki. Spike-pcDNA3.1 transfekowano komórkami HEK293 i inkubowano przez 9 godzin. Po inkubacji nattokinazę (25 i 2,5 μg/ml) dodano do pożywki hodowlanej i dalej inkubowano przez 13 godzin. Komórki utrwalono i przeprowadzono analizę immunofluorescencyjną. Białko S na powierzchni komórki zostało zabarwione przeciwciałem anty-spike (Czerwony), a jądro zostało zabarwione DAPI (Niebieski). (B) Stosunek powierzchni białka S do dodatniego obszaru jądra. Na próbkę przechwycono trzy obrazy i obliczono obszary dodatnie białka S / jądra. Dane są pokazane jako średnia + SD, a wartość p została określona przez jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya przy użyciu oprogramowania R (R-3.3.3 dla Windows) (** p < 0,01; *** p < 0,001). (C) Żywotność komórek oceniano za pomocą testu MTT. Wskazaną nattokinasę dodano do pożywki hodowlanej i inkubowano przez 13 godzin; Wykonano test MTT.
W tym badaniu wykazaliśmy, że aktywność proteazy nattokinazy przyczynia się do degradacji białka S. Nattokinase ma degradujący wpływ nie tylko na białka S, ale także ACE2 w komórkach gospodarza. Swoistość proteazy nattokinazy byłaby niska, ponieważ GAPDH, białko domowe, uległo jednoczesnej degradacji w ocenie in vitro nattokinazy zmieszanej z lizatem komórkowym (Supplemental Figure; Rysunek S2). Z drugiej strony, po dodaniu do komórek nie wykazuje żadnego wpływu na żywotność komórek i oczekuje się, że będzie działał jako środek ochronny na powierzchni komórki. Dalsza analiza produktów degradacji nattokinazy przy użyciu spektrometrii mas jest potrzebna do zrozumienia efektów proteolizy.
Nattokinase ma silne działanie degradacyjne dla białka SARS-CoV-2 S, a także wykazano, że wywiera działanie przeciwmiażdżycowe, obniżające poziom lipidów, przeciwnadciśnieniowe, przeciwzakrzepowe, fibrynolityczne, neuroprotekcyjne, przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe [20]. Pacjenci z nadciśnieniem tętniczym i chorobami współistniejącymi układu sercowo-naczyniowego mogą łatwo zachorować na COVID-19 [21]. Ze względu na pojawienie się licznych wariantów SARS-CoV-2, w tym szczepów ze zmutowanymi epitopami docelowymi szczepionek, samo szczepienie może nie całkowicie chronić przed zakażeniem SARS-CoV-2. Ekstrakty nattokinase i natto mają potencjał, aby zostać opracowane jako nowa generacja leków do zapobiegania i leczenia COVID-19.
3. Materiały i metody
3.1. Materiały
Nattokinase została pozyskana z Contek Life Science Co., Ltd. (Taipei City, Tajwan). Aktywność nattokinazy wynosiła 60 000 FU/g (FU, jednostka fibrynolizy). Zestawy koktajlowe inhibitorów proteazy I i III zostały zakupione w FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation (Osaka, Japonia). Plazmid ekspresyjny (pcDNA3.1-SARS2-Spike C9 ze znacznikiem na C-końcu, pcDNA3.1-hACE2 i pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP) został zakupiony od Addgene (Watertown, MA, USA). Komórki HEK293 (JCRB9068) uzyskano z Banku Komórek JCRB (Osaka, Japonia).
3.2. Hodowla komórkowa i Western Blotting
Komórki HEK293 hodowano w gęstości 3,5 × 105 komórek / ml w DMEM uzupełnione 10% FBS, L-glutaminą, 100 U / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny przez noc. Komórki transfekowano z każdym plazmidem (pcDNA3.1-SARS2-Spike, pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP lub pcDNA3.1-hACE2) i inkubowano przez 22 godziny. Po inkubacji hodowane komórki zeskrobano i przemyto lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (D-PBS). Przeprowadzono zliczanie komórek i dodano bufor xTractor (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia) do osadu komórkowego. Lizaty komórkowe odwirowano w temperaturze 1300× g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a supernatant przeniesiono do nowych probówek i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Stężenie białka oznaczano za pomocą testu białkowego kwasu bicyndonowego (BCA) przy użyciu zestawu do oznaczania BCA (Takara). Dziesięć mikrolitrów nattokinazy i 10 μl lizatu komórkowego (1 μ μg/ml) inkubowano w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Gdy zastosowano działanie inhibitorów proteazy, zestawy koktajli inhibitorów proteazy I i III rozcieńczono 10-krotnie D-PBS, a do mieszaniny nattokinazy i lizatu komórkowego dodano roztwór koktajlowy inhibitora proteazy o pojemności 10 μL. Załadowano równe objętości mieszaniny reakcyjnej i wykonano Western blotting. Pierwszorzędowe przeciwciała obejmowały mysie przeciwciało monoklonalne anty-rodopsyny (C9) (1D4) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH (FUJIFILM Wako), przeciwciało monoklonalne myszy znacznik GFP (Proteintech, Rosemont, IL, USA) i przeciwciało anty-ACE2 (Proteintech). Przeciwciała wtórne obejmują sprzężone z HRP przeciwciało anty-mysie kozie (Proteintech).
3.3. Oznaczenie immunofluorescencji
Komórki HEK293 hodowano w gęstości 3,5 × 105 w komorze 8-dołkowej w DMEM uzupełnionej 10% FBS, L-glutaminą, 100 U / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny. Komórki transfekowano pcDNA3.1-SARS2-Spike i inkubowano przez 9 godzin. Po inkubacji komórki poddano działaniu próbek, inkubowano przez 13 godzin i utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut. Po inkubacji przeciwciałem monoklonalnym SARS-CoV/SARS-CoV-2 (1A9) (GeneTex, CA, USA) przez 1 h inkubowano go z kozim przeciwciałem antymysim skoniugowanym przez Cy3 przez 1 godzinę. Szkiełka zostały zabarwione DAPI Fluoromount-G i obserwowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (BZ-X710, Keyence, Osaka, Japonia). Obszary dodatnie i jądro-dodatnie zostały obliczone za pomocą oprogramowania analitycznego dołączonego do BZ-X710 (analizator BZ-X). Żywotność komórek oceniano za pomocą testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowego (MTT). Komórki hodowano na 24-dołkowych płytkach hodowlanych. Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 24 godziny próbki dodawano do każdego basenika i inkubowano przez kolejne 13 godzin. Komórki zawieszono w 500 μl DMEM zawierającego 500 μg/ml MTT. Po inkubacji przez 3 godziny w temperaturze 37 °C dodano 500 μl izopropanolu zawierającego 4 mM HCl w celu rozpuszczenia MTT formazanu. Absorbancję zmierzono przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
4. Wnioski
W tym badaniu wykazaliśmy, że nattokinase, proteaza serynowa, degraduje białko S SARS-CoV-2. Aby zbadać, czy nattokinaza zawarta w ekstrakcie natto może hamować infekcję SARS-CoV-2, przeanalizowaliśmy degradację białka S poprzez zmieszanie lizatu komórek ekspresji białka S i nattokinazy w sposób zależny od dawki i czasu. RBD białka S wiąże się z błonowo-dystalną częścią białka ACE2. Doniesiono, że ekstrakt Natto hamuje infekcję SARS-CoV-2 w komórkach Vero E6 poprzez degradację RBD [16]. Wykazaliśmy, że degradacja białka S przez nattokinazę została zablokowana przez leczenie termiczne lub inhibitorami białka. Nasze dane sugerują, że aktywność proteazy nattokinazy odgrywa kluczową rolę w degradacji białka S. Podsumowując, odkrycia te potwierdzają pogląd, że hamowanie infekcji SARS-CoV-2 przez ekstrakt natto było spowodowane degradacją białka S przez nattokinazę. Tak więc nasze dane wskazują, że nattokinaza i ekstrakty natto mają potencjalny wpływ na hamowanie wejścia komórek gospodarza SARS-CoV-2 poprzez degradację białka S.
Odniesiesz sie do tego @Blue?
Jak pozbyc sie szczepionki?
Jak pozbyc sie tlenku grafenu?
Jak zaklocic sygnal bluetooth?
Czy k2mk7 z Natto ma tez nattokinaze?
Ile nattokinazy mozna pobierac dziennie?
Przeciwwzkazania?
Globalna sieć osób nieszczepionych dąży do utworzenia banku krwi wolnego od szczepionek mRNA krew niezaszczepionych na wagę złota
🩸Szwajcarska organizacja pozarządowa buduje ogromną globalną sieć nieszczepionych osób, której krótkoterminowymcelem jest połączenie nieszczepionych dawców i biorców krwi na całym świecie. Docelowo Safe Blood Donation zamierza założyć bank krwi wolnej od szczepionek mRNA.Przerażony zaszczepioną krwią, którą badał i przekonany,że cała sprawa ze szczepieniami polega głównie nakontrolowaniu ludzi
🩸Szwajcarska organizacja pozarządowa buduje ogromną globalną sieć nieszczepionych osób, której krótkoterminowymcelem jest połączenie nieszczepionych dawców i biorców krwi na całym świecie. Docelowo Safe Blood Donation zamierza założyć bank krwi wolnej od szczepionek mRNA.Przerażony zaszczepioną krwią, którą badał i przekonany,że cała sprawa ze szczepieniami polega głównie nakontrolowaniu ludzi
